Séquençage de produit PCR, ADN plasmidique ou de phage et séquençage des extrémités BAC/PAC

  1. Ouverture d’un compte

Complétez le formulaire de demande de séquençage.

Cliquez sur « soumettre », il sera envoyé par e-mail.

Vous recevrez un mot de passe et un nom d’utilisateur pour accéder à Nanuq, notre application web. Vous pourrez ensuite soumettre vos échantillons en ligne.

Si l’un des échantillons à séquencer dans votre projet provient directement ou indirectement de sujets humains (par exemple, un produit PCR provenant de l’ADN génomique humain), veuillez joindre une copie de la lettre d’approbation du comité d’éthique de votre institution.

  1. Format de soumission

Nous n’acceptons que ces formats :

Tubes « strip » PCR

Plaques PCR à 96 puits

Si vous avez plus de 48 échantillons, vous devez utiliser la plaque à 96 puits.

Nous vous suggérons les produits suivants :

Tubes « strip » PCR : UltiDent Scientific, tubes à parois fines de 0,2 ml, 12 tubes avec bandes et bouchons dome, catalogue n° 185-AB-0266

Plaques PCR à 96 puits : Corning, Thermowell® GOLD 96 Well Clear Polypropylene PCR Microplate, Half Skirt, Nonsterile, produit n° 3753

Films adhésifs pour plaque : Applied Biosystems, MicroAmp Clear Adhesive Films, catalogue n° : 4306311

  1. Organisation des échantillons et des amorces
  • Tubes « strip » PCR : regroupez tous les échantillons (plasmides ou produits PCR) les uns après les autres. Les tubes doivent être correctement étiquetés avec l’ID de puits correspondant sur le formulaire de soumission des échantillons. Exemple : A01, A02, A03…
    La même méthode s’applique aux amorces ; elles doivent être correctement étiquetées et aliquotées dans les tubes « strip » PCR dans le même ordre que leurs échantillons d’ADN associés.
  • Plaques PCR à 96 puits : regroupez tous les échantillons (plasmides ou produits PCR) les uns après les autres en commençant par le puits A01 et en suivant l’ordre de la plaque, c’est-à-dire de A01 à A12, de B01 à B12, etc. Les amorces doivent être aliquotées dans le même ordre que leurs échantillons d’ADN associés, sur la même plaque, dans les rangées inférieures si l’espace le permet, ou dans une autre plaque correctement étiquetée.
  • Si 48 échantillons ou plus doivent être séquencés avec la même amorce, vous pouvez fournir un seul tube d’amorce pour ces échantillons (10 μl d’amorce/échantillon).
    Si vous devez séquencer de 2 à 47 échantillons avec la même amorce, vous devez fournir autant de tubes (ou puits) d’amorce que vous avez d’échantillons à séquencer avec cette amorce (10 μl d’amorce/échantillon).
    Si vous devez séquencer un échantillon avec plusieurs amorces, cet échantillon doit être aliquoté dans autant de tubes (ou puits) que vous avez d’amorces différentes.
  • Les échantillons et les amorces doivent être organisés exactement dans les mêmes positions que celles indiquées sur votre formulaire de soumission des échantillons.
    Veillez à bien sceller vos plaques ou à capuchonner vos tubes. (Ne pas utiliser de parafilm ou de ruban adhésif). Étiquetez clairement vos échantillons sur chaque tube avec le numéro d’ID de puits (A1, A2…).
  1. Préparation des échantillons d’ADN

Volume et concentration requis pour le séquençage :

Sample Type Volume Concentration Quantity
Unpurified PCR 20 μl Length of PCR product
Purified PCR 5 μl Minimum
100-200 bp 0.5-1.5 ng
200-500 bp 1.5-5 ng
500-1000 bp 2-10 ng
1000-2000 bp 5-20 ng
>2000 bp 20-50 ng
Plasmid DNA or Phage ** 5 μl Minimum 100-500 ng/μl
BAC/PAC End Sequencing ** 20 μl Minimum 500 ng/μl

*Nous proposons un service de purification de vos produits PCR afin d’éliminer les dNTP non incorporés et les amorces PCR inutilisées.

** Nous proposons également un service d’extraction d’ADN plasmidique au format 96 puits, uniquement à partir de colonies fraîches ou de stocks de glycérol (voir section 5).

  • Les produits PCR ayant été séparés sur gel doivent être accompagnés d’une image du gel d’agarose des produits.

Si vous souhaitez utiliser notre service de purification PCR, vous devez fournir un produit PCR avec un seul produit d’amplification (une seule bande sur le gel), car un produit d’amplification supplémentaire ne peut pas être éliminé par notre procédure de purification.

Les produits PCR de moins de 100 pb ne peuvent pas être séquencés.

  • Pour l’ADN plasmidique, veillez à ne laisser aucune trace de phénol, chloroforme ou éthanol. Ne pas resuspendre l’ADN dans de l’EDTA. Utilisez du Tris 10 mM, pH 8 ou de l’eau.

Il est très important de vérifier la qualité et la quantité de votre échantillon (un ratio OD260/OD280 entre 1.9 et 1.7).

Les kits d’extraction d’ADN de marques reconnues donnent de très bons résultats si leurs protocoles sont suivis correctement.

Important : Il est de votre responsabilité de fournir des échantillons de bonne qualité en quantités suffisantes.

  1. Extraction d’ADN plasmidique à partir de clones bactériens

Un service d’extraction d’ADN plasmidique à partir de colonies fraîches ou de stocks de glycérol est proposé uniquement au format 96 puits. Si une plaque à 96 puits ne peut pas être remplie, la plaque partielle sera réalisée au tarif d’une plaque entière.

Les clones peuvent être soumis de deux manières : sous forme de colonies fraîches cultivées sur une boîte de Petri contenant de l’agar pendant environ 16 heures, ou sous forme de stocks de glycérol congelés. Toutes les colonies fraîches doivent être envoyées à notre laboratoire avant jeudi midi. Dans ce cas, nous préparerons des stocks de glycérol pour chaque échantillon dans une plaque à 96 puits.

Les plaques de stocks de glycérol doivent être envoyées avec suffisamment de glace carbonique pour que les clones restent congelés jusqu’à leur réception.

Si vous soumettez des stocks de glycérol nécessitant plus d’un antibiotique, vous devez organiser votre soumission de manière à regrouper tous les échantillons nécessitant le même antibiotique.

Tous les clones soumis ou préparés par nos soins seront conservés pendant une période limitée de 30 jours, après quoi ils seront éliminés. Tous les échantillons que vous souhaitez conserver doivent être récupérés dans ce délai. Si vous n’êtes pas en mesure de les récupérer, vous devez nous fournir un numéro FedEx ou équivalent, car nous ne prendrons pas en charge les frais de transport.

  1. Préparation des amorces

Concentration et volume requis par échantillon pour le séquençage :

Volume Concentration
Amorce 10 μl

La plateforme de séquençage fournit gratuitement le jeu standard des amorces courantes suivantes :

Amorce Séquence
T7 5’ – TAATACGACTCACTATAGGG – 3’
T3 5’ – AATTAACCCTCACTAAAGGG – 3’
SP6 5’ – TATTTAGGTGACACTATAG – 3’
M13 forward 5’ – GTAAAACGACGGCCAGT – 3’
M13 reverse 5’ – GGAAACAGCTATGACCATG – 3’
BGH reverse 5’ – TAGAAGGCACAGTCGAGG – 3’
T7 terminator 5’ – GCTAGTTATTGCTCAGCGG – 3’

Les séquences obtenues ne sont clairement lisibles que sur 30 à 60 bases à partir de l’extrémité 3’ de l’amorce.

Un modèle d’ADN de bonne qualité, fourni en quantité suffisante, peut produire jusqu’à 800 bases de séquence de bonne qualité.

Les produits PCR peuvent généralement être séquencés en utilisant l’une des deux amorces PCR.

Il vous revient de déterminer quelles amorces sont nécessaires pour séquencer vos échantillons.

La conception de l’amorce de séquençage est essentielle pour obtenir de bons résultats :

  • La longueur de l’amorce doit être comprise entre 18 et 24 bases.
  • Le rapport G/C doit être de 40 à 60 %.
  • La température d’adhésion de l’amorce doit être supérieure à 50°C.
  • Évitez de concevoir des amorces en amont de régions homo- ou hétéropolymériques (répétitions de A, C, G ou T) car elles sont extrêmement difficiles à séquencer.

Nous vous recommandons d’utiliser le site web suivant pour la conception des amorces :

http://frodo.wi.mit.edu/cgi-bin/primer3/primer3_www.cgi

  1. Soumission en ligne des échantillons

Tous les échantillons d’ADN et de clones bactériens pour séquençage doivent être soumis en ligne via Nanuq, notre application web, une fois que vous avez ouvert un compte.

[Guide PDF] pour la soumission en ligne des échantillons

  1. Où envoyer vos échantillons

Les échantillons peuvent être envoyés par courrier ou remis en personne entre 9h00 et 17h00, du lundi au vendredi.

Les échantillons doivent être adressés à :

Corine Zotti
McGill University and Genome Quebec
Innovation Centre
740, avenue Docteur Penfield,
Salle 7300
Montréal, QC H3A 1A4
Téléphone : 514-398-3311, poste : 00522
Fax : 514-398-1795

  • Vous devez imprimer le bon de transport de l’étape de soumission et l’ajouter à votre colis.
  • Nous ne sommes pas responsables des échantillons arrivant dans des tubes, plaques ou tubes « strip » endommagés, ni des échantillons ayant évaporé. Nous ne sommes pas non plus responsables des retards d’expédition ou des retards dus à des échantillons mal étiquetés.
  • Tous les échantillons sont conservés à 4°C pendant un maximum de deux semaines après le séquençage. En raison de contraintes de stockage, les échantillons non réclamés seront éliminés.
  1. Transmission des résultats
  • Tous les résultats sont directement accessibles sur notre application web Nanuq. Vous pourrez visualiser les chromatogrammes ou les textes (format FASTA ou GenBank) et les télécharger.
  • Une fois téléchargées, vous pouvez les visualiser avec Chromas. Une version gratuite pour PC est disponible à cette adresse :
    http://www.technelysium.com.au/chromas.html
  • Toutes les séquences sont disponibles sur Nanuq pendant au moins un an. Après ce délai, elles sont archivées et peuvent être mises à disposition sur demande. Les clients peuvent nous demander de retirer leurs données de Nanuq à tout moment.
  • Nous ferons de notre mieux pour traiter vos échantillons dans un délai de 2 à 4 jours ouvrables après leur réception. Cependant, cela peut varier en fonction de la demande de séquençage.
  • Il est indispensable de suivre attentivement nos directives pour éviter tout retard dans le traitement de vos échantillons.
  • Un message automatique vous sera envoyé lorsque vos résultats seront disponibles sur Nanuq.
  1. Dépannage
  • Les petits produits PCR (150 pb à 250 pb) donnent des séquences avec des scores de qualité moyens plus bas en raison de la saturation (plus le fragment est petit, plus les lectures sont intenses) et de la compression des bases qui se produit au début de toutes les séquences. Cela est dû à la technologie d’électrophorèse capillaire du 3730.
  • Les échantillons de bonne qualité avec les concentrations recommandées peuvent généralement produire jusqu’à 800 bases de séquence de bonne qualité.

Si vous avez des questions concernant vos résultats, n’hésitez pas à nous contacter à l’adresse suivante : [email protected]

  1. FAQ

Questions fréquemment posées

Soumission des échantillons

  • Comment dois-je organiser physiquement mes échantillons et/ou amorces lorsque je les envoie au service de séquençage ?
  • Quelle quantité/concentration d’ADN dois-je fournir pour le séquençage ?
  • Quelle quantité/concentration d’amorce dois-je fournir pour le séquençage ?
  • Quelles sont les amorces fournies par le service de séquençage ?
  • Quel formulaire dois-je choisir lorsque je soumets mes échantillons via Nanuq (étape 1 de la soumission) ?

Résultats

  • Une fois que mes échantillons ont été reçus et acceptés par le service de séquençage, combien de temps faut-il pour voir mes séquences sur Nanuq ?
  • Comment puis-je visualiser et analyser mes séquences ?
  • Quelle longueur puis-je attendre de mes séquences ?
  • Que puis-je faire si mes résultats de séquençage sont de mauvaise qualité ?
  • La version texte de la séquence sur Nanuq est différente du chromatogramme. Pourquoi ?

Facturation

  • Dois-je fournir un numéro de bon de commande ou un numéro de carte de crédit lors de la soumission de mes échantillons ?
  • À qui dois-je envoyer mon paiement pour le service de séquençage ?

Nanuq

  • Quels navigateurs Internet sont compatibles avec Nanuq ?
  1. Formulaires de demande à télécharger

Important :
Il est fortement recommandé de lire les documents de directives des formulaires pour éviter tout retard dans le traitement de votre demande.

Si vos échantillons ont été obtenus directement ou indirectement de sujets humains, veuillez inclure une copie de l’approbation du comité d’éthique de votre institution.

Formulaire de demande de séquençage (ouverture d’un compte / création d’un nouveau projet)

  • [PDF] Formulaire de demande de séquençage

Formulaire de demande de soumission d’échantillons

Les formulaires de soumission d’échantillons doivent impérativement être téléchargés via l’application Web.

  • [PDF] Directives du formulaire de soumission d’échantillons
  1. Tarifs

Tarifs académiques

Les prix n’incluent pas les taxes (TPS/TVQ). Les chercheurs canadiens en dehors du Québec ne paient pas la taxe de la TVQ. Aucune taxe ne s’applique aux chercheurs hors du Canada. Ces prix sont réservés aux laboratoires académiques canadiens uniquement.

Service Prix (CAD)
Extractions d’ADN plasmidique sur plaque à 96 puits 96,00 $
Réaction de séquençage de l’ADN 3,49 $
Réaction de séquençage de l’extrémité BAC ou PAC 5,79 $
Séquençage BAC ou PAC
Préparation BAC grande échelle 200,00 $
Construction d’une bibliothèque de fragments BAC 200,00 $

Les prix sont susceptibles d’être modifiés sans préavis. Les tarifs commerciaux sont disponibles sur demande.

En cas d’échec du séquençage, nous répéterons les réactions sur un nombre limité d’échantillons à votre demande. Si nous déterminons que l’échec des réactions est dû à un problème d’équipement, au kit de réaction de séquençage ou à une erreur humaine, les réactions seront répétées sans frais. En revanche, les échecs dus à une mauvaise qualité d’échantillon sont sous la responsabilité du client.

Politique de facturation

Les projets d’une durée inférieure ou égale à 6 mois seront facturés à la fin du projet, tandis que ceux d’une durée supérieure seront facturés à intervalles réguliers. Dans tous les cas, veuillez fournir les informations de facturation sur le formulaire de demande de séquençage.

Les paiements peuvent être effectués uniquement par chèque ou carte de crédit. Un bon de commande (PO), une demande d’achat ou un numéro de compte peut être ajouté à votre facture sur demande. Le chèque doit être libellé à l’ordre de Genome Quebec et envoyé à l’adresse suivante :

Genome Quebec
630, boulevard René Lévesque, suite 2660
Montréal (Québec) Canada
H3B 1S6